摘要:從制糖廠廢液污泥中分離篩選得到具有高絮凝活性的絮凝菌株 WSZ03，采用分子生物學結(jié)合形態(tài)學特征對 WSZ03 菌株進行鑒定，通過內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)( internal transcribed spacer，簡稱 ITS) 序列分析結(jié)合形態(tài)學觀察確定 WSZ03 屬曲霉屬。探討利用糖蜜乙醇廢液對其進行廉價培養(yǎng)及同時處理糖蜜乙醇廢液的可行性。結(jié)果表明，該菌株培養(yǎng) 48 h 的菌液適合作為絮凝菌種; WSZ03 絮凝菌對糖蜜乙醇廢水的最佳絮凝條件如下: 接種量 2% 、培養(yǎng)時間 36 h、溫度 28 ～ 34 ℃，pH 值 6。糖蜜乙醇廢水的化學需氧量( chemical oxygen demand，簡稱 COD) 去除率達到 75. 00% ，色度去除率為 62. 50% ，濁度去除率為 88. 89% 。

　　關(guān)鍵詞:絮凝菌; 糖蜜乙醇廢液; 廉價培養(yǎng); 絮凝條件

　　糖蜜乙醇廢水是以糖廠制糖副產(chǎn)品糖蜜為原料，在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過程中產(chǎn)生的高濃度有機廢水，含有大量碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素等有機物，如果直接排放，會造成水體富營養(yǎng)化，其結(jié)果是水體黑臭，甚至失去功能，從而嚴重影響環(huán)境[1 - 2]。目前，該類廢水的常規(guī)處理方法為生化處理法、化學處理法或多種方法的組合工藝等[3]。微 生 物 絮 凝 劑 ( MBF) 是利用生物技術(shù)，從微生物體或其分泌物中提取純化而獲得的一種天然高分子絮凝劑，該類絮凝劑可使液體中不易降解的固體懸浮顆粒發(fā)生凝聚沉降，是具有生物分解性和安全性的高效、無毒、無二次污染的綠色水處理劑。近年來，有不少學者報道了微生物絮凝劑在污水處理中的應用[4 - 10]，但是由于 MBF 制備成本高，產(chǎn)量低，生產(chǎn)菌種篩選困難，導致目前微生物絮凝劑多處于實驗室研究階段，在工業(yè)上并未得到廣泛推廣。因此，尋找廉價、高效的微生物絮凝劑生產(chǎn)方法，能有效地推動其廣泛應用。針對上述問題，本研究以糖蜜乙醇廢水為培養(yǎng)基主要成分，從糖廠廢液污泥中篩選對糖蜜乙醇廢水具有絮凝活性的絮凝菌，通過比較廢水處理前后的化學需氧量 ( chemical oxygen demand，簡稱 COD) 、濁度、色度的變化，對絮凝菌的最佳絮凝條件進行優(yōu)化，以得到對糖蜜乙醇廢水較理想的處理效果。

　　1 材料與方法

　　1. 1 菌種來源與培養(yǎng)基

　　菌種: 從宜州博慶公司懷遠糖廠的廢水污泥中篩選得到。固體培養(yǎng)基: 10 倍液糖蜜乙醇廢液 1 000 mL，瓊脂粉 20 g，調(diào)節(jié) pH 值為 7. 0。液體培養(yǎng)基: 10 倍液糖蜜乙醇廢水，調(diào)節(jié) pH 值為 7. 0。

　　1. 2 試驗方法

　　1. 2. 1 菌種分離與篩選

　　采用稀釋涂布法將污泥進行梯度稀釋，并涂布在滅菌的平皿培養(yǎng)基上，置于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 ～ 5 d，用劃線法純化得到單一菌落，將純菌落接種于裝有 50 mL 液體培養(yǎng)基的 250 mL 搖瓶中，于 28 ℃、80 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng) 48 h 得到菌株發(fā)酵液，測定菌株發(fā)酵液和初始液體培養(yǎng)基的吸光度，進行絮凝活性的初步分析。

　　1. 2. 2 絮凝率的測定

　　吸取靜置 20 min 的菌株發(fā)酵上清液，采用二極管陣列分光光度計，在550 nm 處測定吸光度( 以 D550 nm( B) 表示) ，取稀釋 10 倍的糖蜜乙醇廢液，以 550 nm 處的吸光度( 以 D550 nm( A) 表示) 為對照，計算絮凝菌的絮凝率: 絮凝率 = ( D550 nm( A) - D550 nm( B) ) /D550 nm( A) × 100% 。

　　1. 2. 3 菌種鑒定

　　采用平板劃線法獲得單菌落，觀察菌落生長形態(tài)，并借助顯微鏡觀察菌絲和孢子形態(tài)，以初步鑒定菌屬，同時結(jié)合基因序列的測定確定菌屬，其中基因序列的測定先使用生工生物工程( 上海) 股份有限公司的 DNA 提取試劑盒提取目標菌株的基因組 DNA，以 ITS1 + ITS4 作為擴增真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)( internal transcribed spacer，簡稱 ITS) 的通用引物，交由生工生物工程( 上海) 股份有限公司測序，再將所得測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心( National Center for Biotechnology Information，簡稱 NCBI) 網(wǎng)站進行 BLAST 比對分析。

　　1. 2. 4 絮凝條件的優(yōu)化

　　1. 2. 4. 1 單因素試驗

　　考察接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和初始 pH 值等 4 個因素對 WSZ03 絮凝效果的影響。 ( 1) 接種量。將于 28 ℃、80 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng) 48 h 得到的菌液作為種子液( 菌體濃度 104 CFU/mL) ，接入糖蜜乙醇廢液裝液量為 50 mL 的 250 mL 三角瓶中，接種量分別為 1% 、2% 、4% 、6% 、8% 、10% ，在搖床中振蕩培養(yǎng)，得到菌株發(fā)酵液，測定菌株發(fā)酵液、發(fā)酵培養(yǎng)基的吸光度，計算絮凝率。 ( 2) 培養(yǎng)時間。在 250 mL 三角瓶中加入 50 mL 糖蜜乙醇廢水，再接入種子液，接著于 28 ℃、80 r/min 搖床中分別培養(yǎng) 6、12、18、24、30、36、42、48 h，得到菌株發(fā)酵液，測定菌株發(fā)酵液、發(fā)酵培養(yǎng)基的吸光度，計算絮凝率。 ( 3) 培養(yǎng)溫度: 在 250 mL 三角瓶中加入 50 mL 糖蜜乙醇廢水，接 入 種 子 液，接 著 分 別 在 22、25、28、31、34、37 ℃ 下 80 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)，得到菌株發(fā)酵液，測定菌株發(fā)酵液和發(fā)酵培養(yǎng)基的吸光度，計算絮凝率。 ( 4) 初始 pH 值: 在 250 mL 三角瓶中加入 50 mL 糖蜜乙醇廢水，利用 1 mol /L HCl、1 mol /L NaOH 分別調(diào)節(jié) pH 值為 3、4、5、6、7、8、9、10 后接入種子液，接著在 28 ℃、80 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)，得到菌株發(fā)酵液，測定菌株發(fā)酵液、發(fā)酵培養(yǎng)基的吸光度，計算絮凝率。

　　1. 2. 4. 2 正交試驗

　　設計接種量、絮凝時間、溫度、初始 pH 值等 4 個因素的 3 個水平，考察影響絮凝率的條件，以得出絮凝菌的最佳絮凝條件，因素水平設計見表 1。

　　1. 2. 5 處理糖蜜乙醇廢水 在最佳絮凝條件下，用絮凝菌對糖蜜乙醇廢水進行處理，比較處理前后水質(zhì)的參數(shù)變化，衡量水質(zhì)參數(shù)的指標為 COD、色度和濁度。采用 COD 測定計( 型號: A - 7325) 測量 COD，采用濁度儀 ( 型號: BTCJ - TSS) 測量濁度，利用色度計( HI93727 色度比色計) 測定色度。

　　2 結(jié)果與分析

　　2. 1 絮凝劑產(chǎn)生菌的選擇

　　從宜州博慶公司懷遠糖廠的廢水污泥中經(jīng)初篩、復篩分離純化得到 1 株具有高絮凝活性的菌株，其絮凝率為 92% ，因此選擇該菌株用于后續(xù)試驗。

　　2. 2 絮凝劑產(chǎn)生菌的鑒定

　　菌種形態(tài)學觀察及 ITS 序列的測序鑒定: 在固體培養(yǎng)基上于 28 ℃培養(yǎng) 2 d，可見白色菌絲，3 d 開始產(chǎn)生孢子，5 d 時孢子成熟。菌落直徑約為 3 cm，正面干燥蓬松，呈灰棕色( 圖 1 - a) ; 孢子呈圓形、灰色( 圖 1 - b) 。結(jié)合 ITS 測序結(jié)果( ITS 片段長度為 760 bp，圖 2) ，初步判斷 WSZ03 菌株屬于曲霉屬。

　　2. 3 SWZ03 的絮凝率曲線于稀釋

　　10 倍的糖蜜乙醇廢液培養(yǎng)基中接入 1% 絮凝菌孢子懸液，不同培養(yǎng)時間段對糖蜜乙醇廢液的絮凝效果見圖 3。可以得出，該菌培養(yǎng)在 48 h 時達到較高的絮凝活性，通過測定菌體濕質(zhì)量可知，此時菌體的生物量也已經(jīng)達到最高水平。因此，后續(xù)試驗均采用培養(yǎng) 48 h 的菌液作為菌種。

　　2. 4 接種量對 WSZ03 絮凝效果的影響

　　采用“1. 2. 4. 1”節(jié)中的試驗方法，考察接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和初始 pH 值等 4 個因素對絮凝菌絮凝效果的影響。由圖 4 至圖 7 的單因素絮凝試驗結(jié)果表明，接種量對絮凝活性的影響不大，當接種量為 2% 時，絮凝效果明顯; 當培養(yǎng)時間為 36 h 時，絮凝率較高; 培養(yǎng)溫度對絮凝活性的影響亦不明顯，31 ℃ 時的絮凝率較高; 當初始 pH 值為 6 時，絮凝率較高。

　　2. 5 絮凝條件的正交試驗

　　按照“1. 2. 4. 2”節(jié)的試驗方法對以上影響絮凝效果的 4 個因素做 4 因素 3 水平正交試驗。由表 2 可知，4 個因素極差從小到大的順序為時間 < 溫度 < 接種量 < pH值，因此可見，4 個因素對 WSZ03 菌株絮凝效果的影響程度排序為 pH 值 > 接種量 > 溫度 > 時間。結(jié)合單因素試驗結(jié)果，綜合分析得出絮凝菌的最優(yōu)絮凝條件如下: 接種量為 2% ，絮凝時間為 36 h，溫度為 28 ～ 34 ℃，pH 值為 6。

　　2. 6 糖蜜乙醇廢水的處理利用

　　“2. 5”節(jié)中確定的最優(yōu)絮凝條件，測定懷遠糖廠糖蜜乙醇廢水經(jīng) WSZ03 絮凝處理后的 COD、濁度和色度去除率。由圖 8 可知，糖蜜乙醇廢水的 COD 去除率達到 75. 00% ，色度去除率為 62. 50% ，濁度去除率為 88. 89% 。菌株 WSZ03 對糖廠糖蜜乙醇廢液有較好的處理效果，尤其對濁度的清除效果比較明顯。

　　3 結(jié)論與討論

　　本研究利用糖蜜乙醇廢液對微生物絮凝菌進行廉價培養(yǎng)，同時考察處理糖蜜乙醇廢液的可行性。本試驗的優(yōu)勢在于降低了微生物絮凝劑的培養(yǎng)成本。結(jié)果表明，本研究篩選出的 WSZ03 菌株對糖廠糖蜜乙醇廢水有明顯的絮凝效果。菌株 WSZ03 對糖蜜乙醇廢水的最佳絮凝條件如下: 接種量為 2% ，時間為 36 h，溫度為 28 ～ 34 ℃。菌株 WSZ03 所產(chǎn)絮凝活性物質(zhì)對糖蜜乙醇廢水 COD 的去除率為 75. 00% ，色度去除率為 62. 50% ，濁度去除率為 88. 89% 。筆者所在團隊利用 WSZ03 菌株處理其他種類廢水，如重金屬廢水、煤泥廢水等發(fā)現(xiàn)，WSZ03 菌株絮凝劑有寬泛的適用范圍，具有一定的實際應用前景。糖蜜乙醇廢液含有大量難降解的有機物，并且色度高，通過單一絮凝菌株處理很難實現(xiàn)達標排放，因此在實際應用中，需要考慮采用混合菌種產(chǎn)生的復合絮凝劑以增強糖蜜乙醇污水的處理效果，或者與其他處理技術(shù)聯(lián)合使用，進行污水處理研究。

　　參考文獻: [1]Mudoga H L，Yucel H，Kincal N S. Decolorization of sugar syrups using commercial and sugar beet pulp based activated carbons[J].

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