目前已證實I型糖尿病和自身免疫耐受缺失有關，自身反應性T細胞在I型糖尿病的免疫發(fā)病機理中起主導作用[1]。移植胰島細胞治療I型糖尿病是一個具有前景的治療策略，然而自身反應性T細胞的存在是胰島移植治療I型糖尿病方法中最大的障礙。

　　【摘 要】目前已證實I型糖尿病和自身免疫耐受缺失有關，自身反應性T細胞在I型糖尿病的免疫發(fā)病機理中起主導作用。PD-L1已被證實為免疫負性調(diào)節(jié)受體 PD-1的配體，文獻證明PD-L1在免疫負性調(diào)節(jié)及外周耐受中發(fā)揮重要作用。本實驗在前期構建PD-L1表達載體和初步研究其功能的基礎上，進一步研究 PD-L1對同種淋巴細胞的負性調(diào)節(jié)作用，通過建立穩(wěn)定表達PD-L1胰島細胞株，觀察PD-L1對同種淋巴細胞增殖的影響。

　　【關鍵詞】副主任中藥師職稱論文范文,I型糖尿病,PD-L1,NIT-1細胞

　　程序性死亡分子配體-1(PD-L1)和程序性死亡分子配體 -2(PD-L2)已被證實為PD-1的配體[2]。由于PD-L1在非淋巴組織的表達提示PD-L1可以調(diào)節(jié)自身反應性T細胞或B細胞，同時(或者)調(diào)節(jié)靶器官的炎癥反應。有研究表明，PD-L1信號可以介導T細胞的凋亡，在腫瘤細胞逃逸免疫系統(tǒng)攻擊中起重要的作用。通過抗體阻斷PD-1：PD-L1這條通路可促進NOD鼠糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[3]。本實驗在前期構建PD-L1表達載體和初步研究其功能的基礎上，進一步研究PD-L1對同種淋巴細胞的負性調(diào)節(jié)作用，通過建立穩(wěn)定表達PD-L1胰島細胞株，觀察PD-L1對同種淋巴細胞增殖的影響，為PD-L1修飾胰島細胞移植重建糖尿病患者胰島細胞功能研究提供新的策略。

　　1 材料

　　NIT-1細胞株(小鼠胰島β細胞株)由澳大利亞WEH1實驗室惠贈，本室傳代培養(yǎng)與保種。 pEGFP-N1-PD-L1 質(zhì)粒含有表達綠色熒光蛋白(EGFP)基因序列，由本科室構建。陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，抗體、 CFSE購于美國BD公司。

　　2 實驗方法

　　2.1 轉(zhuǎn)染PD-L1基因的NIT-1細胞穩(wěn)定子篩選

　　根據(jù) Lipofectamine2000TM試劑說明書進行。將NIT-1細胞轉(zhuǎn)種于24孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞達到 50～80%的融合;用無血清培養(yǎng)基分別溶解pEGFP-N1/pEGFP-N1-PD-L1和脂質(zhì)體，將脂質(zhì)體與核苷酸混合，室溫下靜置30min后，在24孔板中加入以上混合液，輕混;培養(yǎng)6h后棄轉(zhuǎn)染液，加入完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。流式細胞儀檢測GRP78的表達。

　　2.2 CFSE染色檢測PD-L1修飾NIT細胞對同種淋巴細胞增殖影響

　　將Balb/c小鼠頸椎脫位處死，無菌取脾臟制備成脾淋巴細胞懸液，加入CFSE( 2μmol/L)染色 ，調(diào)整細胞濃度作為同種反應淋巴細胞備用。用0.25%胰酶消化NIT、NIT-PD-L1和NIT-EGFP細胞，洗滌后用DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞濃度，加入無菌絲裂霉素C(終濃度為30μg/ml)，調(diào)節(jié)細胞濃度作為刺激細胞備用。將Balb/c小鼠脾細胞懸液(反應細胞)分別加入24孔培養(yǎng)板中，每孔5×106個細胞;將刺激細胞分別加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔5×105個細胞;實驗分組：① NIT- PD-L1+淋巴細胞;②NIT-EGFP+淋巴細胞;③NIT+淋巴細胞。反應細胞和刺激細胞懸液培養(yǎng)7天后FCM測定淋巴細胞增殖。

　　2.3 統(tǒng)計學分析

　　采用統(tǒng)計軟件SPSS10.0進行方差分析和t檢驗。

　　3 實驗結果

　　3.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)NIT-1細胞中EGPF或PD-L1的表達

　　pEGFP-N1和pEGFP-N1-PD-L1表達載體分別轉(zhuǎn)染NIT-1細胞，培養(yǎng)48h后，經(jīng)FCM檢測EGPF和PD-L1的表達。結果顯示：對照組(NIT)EGPF表達率為0，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染NIT細胞組EGPF表達率為87.2%±5.6，pEGFP-N1-PD-L1轉(zhuǎn)染NIT細胞組EGPF表達率為88%±6.8;對照組(NIT)PD-L1表達率為5.4%±0.8，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染NIT細胞組PD-L1表達率為 4.8%±1.5，pEGFP-N1-PD-L1轉(zhuǎn)染NIT細胞組PD-L1表達率為90%±5.3(P<0.01)。

　　3.2 PD-L1可顯著抑制同種淋巴細胞增殖

　　CFSE染色流式細胞儀檢測結果顯示：NIT- PD-L1+淋巴細胞組增殖指數(shù)為(4.5±1.6);NIT-EGFP+淋巴細胞組增殖指數(shù)為(9.1±2.1);NIT+淋巴細胞組增殖指數(shù)為(8.5±3.1)。結果說明PD-L1可以抑制同種淋巴細胞增殖，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

　　4 討論

　　PD- L1是正性或負性調(diào)節(jié)T細胞受體(TCR)介導的信號通路B7家族成員之一[4]。一些體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠，體內(nèi)應用拮抗的單克隆抗體(mAb)阻斷B7-H1可以活化效應T細胞，結果促進了自身免疫性糖尿病的發(fā)生發(fā)展，在半抗原誘導的小鼠接觸性過敏反應模型或?qū)嶒炐宰陨砻庖咝阅X脊髓炎模型中，B7-H1基因敲除同樣促進了自身免疫性疾病的、發(fā)生發(fā)展[5-6]。以上結果說明，PD-L1在同種免疫應答中的重要負性調(diào)節(jié)功能。本實驗以PD-L1真核表達載體轉(zhuǎn)染NIT-1細胞作為體外細胞模型，研究PD-L1的負性調(diào)節(jié)功能。從細胞混合培養(yǎng)結果可以看出，PD-L1抑制淋巴細胞的增殖，提示PD-L1抑制反應性淋巴細胞的活化。本實驗證明PD-L1對同種免疫應答具有負性調(diào)節(jié)功能，并初步探討了其機制，對于誘導并維持免疫耐受具有一定作用。

　　【參考文獻】

　　[1]Atkinson MA， Kaufman DL， Campbell L， et al. Response of peripheral-blood mononuclear cells to glutamate decarboxylase in insulin-dependent diabetes[J]. Lancet，1992：339，458. 　　[2]Freeman GJ， Long AJ， Iwai Y， et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation[J]. J. Exp. Med.， 2000：192，1027.

　　[3]Ansari MJ， Salama AD， Chitnis T， Smith RN， Yagita H， Akiba H， Yamazaki T， Azuma M， Iwai H， Khoury SJ， Auchincloss H Jr， Sayegh MH.The Programmed Death-1 (PD-1) Pathway Regulates Autoimmune Diabetes in Nonobese Diabetic (NOD) Mice[J]. J Exp Med.， 2003：63，69.

　　[4]Chen L. Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity[J]. Nat Rev Immunol， 2004，4：336-47.