摘要：為了控制和測定枸杞葉的黃酮含量，建立HPLC測定蘆丁的方法。采用PhnomenexC18（2.5×150mm），流動相為甲醇，0.1%磷酸水，流速1.0ml/min，檢測波長為254nm,外標(biāo)法定量。結(jié)果表明該方法穩(wěn)定，枸杞葉蘆丁含量9月份達(dá)到最高，8月份的含量次之。
　　關(guān)鍵詞：枸杞葉；黃酮；HLPC
　　枸杞葉，又稱為天精草，為常用的傳統(tǒng)中藥，其有效成分主要為黃酮類化合物[1]。研究發(fā)現(xiàn)黃酮類成分具有止咳、平喘、祛痰之功效，并能擴(kuò)張冠狀動脈及降低血膽固醇，有增強(qiáng)心臟收縮、減少心臟搏動數(shù)及明顯的抗氧化等作用[2-5]。供試枸杞葉分別于5月、6月、7月、8月、9月和10月中旬采自青海省都蘭的同一批枸杞枝條，海拔3800m，經(jīng)盧學(xué)峰和梅麗娟兩位高級工程師鑒定為寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)。全株自然陰干，粉碎后備用。
　　1、儀器與設(shè)備
　　1.1儀器：美國Agilent1200型高效液相色譜儀[四元梯度泵，DAD檢測器，Agilent1200色譜工作站]；AG204電子分析天平；KQ2250DB型數(shù)控超聲提取儀；RT29型中藥粉碎機(jī)；超純水機(jī)。
　　1.2試劑：色譜用甲醇為色譜純；純凈水為18.25兆歐的超純水；提取用甲醇，H3PO4均為分析純。蘆丁對照品購自中國藥品生物制品檢定所,純度大于98%。
　　2、方法與結(jié)果
　　2.1色譜條件：色譜條件為PhnomenexC18（2.5×150mm）柱，流速為1.0ml/min，柱溫為25℃，檢測波長254nm，流動相A為甲醇，B為0.1％磷酸溶液，0-20min，45%A；20-30min，45A-65％A。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖分別見圖1。
　　
　　圖1a供試溶液的色譜圖b蘆丁對照品的色譜圖
　　2.2對照品溶液的制備：分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的蘆丁對照品7.0mg，溶解于10ml的容量瓶中，既得0.7mg/ml的溶液，搖勻，0.45μm的微孔濾膜過濾后作為對照品溶液。
　　2.3供試溶液的制備：不同時間采集的枸杞葉樣品各取約1g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇25mL，超聲提取20分鐘，過濾，定容至50ml的容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，既得。
　　2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍：精密吸取對照品溶液2，4，6，8，10μL，在2.1項(xiàng)色譜條件下依次進(jìn)樣，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得蘆丁的線性回歸方程：Y=2454.632X-32.12，r=0.9999。
　　2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)：取枸杞葉按照2.3項(xiàng)下方法配制成溶液,分別在0、3、6、9、12h后在上述色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果蘆丁的面積RSD為0.81%，表明樣品在12小時內(nèi)穩(wěn)定。
　　2.6精密度試驗(yàn)：取2.5項(xiàng)下枸杞葉溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果槲皮素的峰面積的RSD為0.84%，說明該實(shí)驗(yàn)的精密度良好。
　　2.7重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取枸杞葉樣品1共5份，每份1.0g，分別按照2.3項(xiàng)下方法配成溶液，精密吸取10μL進(jìn)樣分析，蘆丁的峰面積RSD為1.53%(n=5)，說明該方法重復(fù)性較好。
　　2.8加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已知蘆丁含量的枸杞葉藥材5份，每份1.0g，加入對照品溶液，制備樣品溶液。精密吸取10μL進(jìn)樣分析，計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果見表1。
　　表1加樣回收率
　　測定成分 樣品含量（mg/g） 加入量（mg） 測得量/（mg/g） 回收率（%） RSD（%）
　　蘆丁 1.2 1 2.17 98.6% 1.6
　　2.9樣品含量測定：分別精密吸取樣品溶液和混合對照品各10μL，注入高效液相色譜儀中，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，測定峰面積積分值，按外標(biāo)法計(jì)算樣品溶液中蘆丁含量，結(jié)果見表2。
　　表2不同月份黃酮含量
　　月份 黃酮含量（mg/g）
　　5 1.2
　　6 1.4
　　7 1.8
　　8 3.0
　　9 3.2
　　10 2.5
　　3、討論
　　考慮了甲醇、乙醇作為溶媒進(jìn)行提取溶劑的選擇(無水乙醇、60%甲醇、80%甲醇、甲醇)，并對不同提取時間(20，30，40min)和不同提取方法(超聲、回流及微波)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示甲醇20min超聲提取效率最高，且槲皮素和山奈酚測得含量高。
　　
　　圖3不同月份枸杞葉蘆丁含量變化
　　從圖3可以看出隨著枸杞葉采集月份不同，其蘆丁含量呈明顯的先增加后減弱的趨勢，而且9月份枸杞葉的蘆丁含量最高，這為枸杞葉的采摘提供了理論基礎(chǔ)。即該類地區(qū)枸杞葉自4月底、5月初出芽后，持續(xù)生長約至10月便會變黃脫落，繼而新發(fā)第二批葉片，因此，采自9月中旬的枸杞葉，其中次生代謝物的含量積累量達(dá)到一個新的高度。通過對不同采收期枸杞葉中蘆丁含量的動態(tài)變化規(guī)律研究可以為枸杞葉藥材的產(chǎn)地選擇及最佳采收期的確立提供一定的數(shù)據(jù)參考，也為進(jìn)一步開發(fā)枸杞葉的藥用功能和擴(kuò)大黃酮類藥物的藥源提供一定的依據(jù)。
　　參考文獻(xiàn)
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　　作者簡介：吳桂玲，女，1983年生，青海樂都人，碩士研究生，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品分析檢測工作。