自1981年在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，艾滋病(AIDS)就呈不斷蔓延的趨勢(shì)[1]。2017年全球共報(bào)告新發(fā)HIV感染180萬(wàn)(140萬(wàn)～240萬(wàn))，HIV感染者達(dá)3690萬(wàn)人(3110萬(wàn)～4390萬(wàn))[2]。2017年(2017年1月1日零時(shí)至12月31日24時(shí))全國(guó)(不含港澳臺(tái))共報(bào)告法定傳染病發(fā)病7030879例，死亡19796人，其中艾滋病死亡15251例(77.04%)[3]。目前艾滋病尚未有根治的方法和有效的疫苗，因此艾滋病的防治工作主要是控制艾滋病的傳播，以預(yù)防為主，普及艾滋病的檢測(cè)，盡早地發(fā)現(xiàn)感染者[4]。而HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)則是開(kāi)展艾滋病各項(xiàng)預(yù)防、治療以及干預(yù)措施的基本手段之一。HIV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要包括血清學(xué)檢測(cè)、淋巴細(xì)胞檢測(cè)和核酸檢測(cè)[5]。血清學(xué)檢測(cè)一般用于艾滋病常規(guī)篩查和確證實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)血清中HIV抗原或(和)抗體，易于自動(dòng)化且成本較低[6]，但是不能應(yīng)用于HIV感染者的治療及用藥監(jiān)測(cè)。淋巴細(xì)胞檢測(cè)主要用于了解機(jī)體的免疫狀態(tài)、確定用藥治療時(shí)機(jī)及疾病分期、判斷治療效果和臨床并發(fā)癥等[7]，但是這種方法的特異性較低，僅作為艾滋病患者確證后的檢測(cè)手段，不能用于艾滋病的早期診斷。而核酸檢測(cè)由于靈敏度和特異性高，窗口期短[8](HIV感染者血漿中HIVRNA出現(xiàn)時(shí)間早，病毒感染后約10天，在血漿中病毒載量即達(dá)到核酸擴(kuò)增技術(shù)可檢測(cè)出的水平)，因此可以用于艾滋病的早期診斷，并且其在臨床治療效果、耐藥性的監(jiān)測(cè)及病程的監(jiān)控、預(yù)測(cè)等方面均有廣泛的應(yīng)用[9]。根據(jù)不同的應(yīng)用場(chǎng)景，HIV核酸檢測(cè)可以分為：大型醫(yī)院、基層衛(wèi)生服務(wù)機(jī)構(gòu)(社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心、鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院等)以及家庭檢測(cè)。

　　1大型醫(yī)院的HIV核酸檢測(cè)

　　目前臨床上很多大型醫(yī)院如三級(jí)醫(yī)院等都有分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，能夠滿足HIV核酸檢測(cè)的環(huán)境及人員要求。在大型醫(yī)院，HIV的核酸檢測(cè)主要依賴于自動(dòng)化或半自動(dòng)化的大型儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)較高通量的核酸檢測(cè)，滿足大樣本量的需求，可分為定性和定量檢測(cè)。截至目前，通過(guò)我國(guó)藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械注冊(cè)且仍在有效期內(nèi)的HIV核酸檢測(cè)試劑有11種(表1)，其中進(jìn)口產(chǎn)品3項(xiàng)，國(guó)產(chǎn)8項(xiàng)。定性檢測(cè)主要用于艾滋病的早期診斷，常用的檢測(cè)試劑盒有歐盟批準(zhǔn)生產(chǎn)的AbbottM2000HIV-1RNA/DNA定性檢測(cè)試劑，使用Taqman探針?lè)ㄟM(jìn)行檢測(cè);美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局(FoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的Gen-Probe公司生產(chǎn)的AptimaHIV-1RNA核酸定性檢測(cè)試劑在臨床中也有應(yīng)用[10]，其檢測(cè)原理為轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)(transcriptionmediatedamplification，TMA)結(jié)合化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的探針雜交檢測(cè)，檢測(cè)的靶基因?yàn)镠IV-1LTR和多聚酶基因。定量檢測(cè)可用于艾滋病的早期診斷、監(jiān)測(cè)抗病毒治療效果及疾病進(jìn)展。臨床上常用的定量檢測(cè)試劑包括美國(guó)羅氏分子診斷公司研發(fā)的RocheCobasTaqManv2.0和美國(guó)AbbottMolecular公司生產(chǎn)的AbbottRealTimeHIV-1檢測(cè)試劑盒。其技術(shù)主要基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)的方法對(duì)血清中HIV核糖核酸/脫氧核糖核酸(RNA/DNA)進(jìn)行定量分析，上述兩種試劑盒主要應(yīng)用了Taqman水解探針?lè)ǎ��?996年美國(guó)PerkinElmer公司發(fā)明TaqMan技術(shù)以來(lái)[11]，該技術(shù)如今已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到HIV基因檢測(cè)[12]。法國(guó)Biomerieux公司生產(chǎn)的NucliSENSEasyQHIV-1v2.0應(yīng)用了分子信標(biāo)技術(shù)，這種基于非水解探針的分子信標(biāo)技術(shù)也是較常用的一種核酸檢測(cè)方法，在檢測(cè)HIV-1病毒載量時(shí)與TaqMan探針?lè)ň哂休^好的相關(guān)性和一致性[13-14]，但分子信標(biāo)探針設(shè)計(jì)較為復(fù)雜且成本較高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與常規(guī)的PCR技術(shù)相比[15]，特異性更高，不僅能夠有效地解決PCR過(guò)程的污染問(wèn)題，而且具有自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR在市場(chǎng)上應(yīng)用廣泛，我國(guó)常用國(guó)內(nèi)外的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑進(jìn)行檢測(cè)。深圳凱杰公司、廣州達(dá)安公司等均已研發(fā)出HIV核酸診斷試劑投入市場(chǎng)[16]。美國(guó)SiemensHealthcareDiagnostics公司基于分支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)(branchedDNA，bDNA)研發(fā)了VER-SANTHIV-1RNAbDNA3.0檢測(cè)試劑盒。bDNA技術(shù)于1989年由美國(guó)Chiron公司研發(fā)[17]，基于特殊的分支鏈信號(hào)放大系統(tǒng)，靶標(biāo)被捕獲探針捕獲后，與各級(jí)探針雜交，最后用與bDNA放大序列互補(bǔ)的堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的寡核苷酸通過(guò)雜交與bDNA分子結(jié)合。通過(guò)對(duì)化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度的測(cè)定對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行定量檢測(cè)[18]。由于反應(yīng)過(guò)程不依賴于核酸擴(kuò)增，因此不存在擴(kuò)增產(chǎn)物的污染問(wèn)題，這是該技術(shù)的一大優(yōu)勢(shì)，但如何提高檢測(cè)的靈敏度是該技術(shù)的難點(diǎn)。同時(shí)該技術(shù)的缺陷在于信號(hào)放大探針在制備上難度較大且操作步驟過(guò)于繁瑣，限制了其在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。上述試劑所需的配套儀器成本高、體積大，對(duì)操作人員的專(zhuān)業(yè)要求較高，適用于樣本量較大的大型中心醫(yī)院的檢測(cè)。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)報(bào)道，考慮到HIV檢測(cè)的特殊性，避免誤診，《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范(2015年修訂版)》中建議用5000拷貝/mL作為判斷結(jié)果的閾值，兩次定量檢測(cè)更有助于準(zhǔn)確判斷結(jié)果[19]。對(duì)于評(píng)估抗病毒藥物療效和病程進(jìn)展，同一病人宜使用相同試劑，有助于合理解讀病毒載量的變化。

　　2基層衛(wèi)生服務(wù)機(jī)構(gòu)的HIV核酸檢測(cè)

　　由于艾滋病復(fù)雜的病程及其難治性，艾滋病患者到大醫(yī)院診治的時(shí)間相對(duì)來(lái)說(shuō)較為短暫，其大部分的時(shí)間是在家庭、社區(qū)中度過(guò)的，HIV的檢測(cè)也應(yīng)當(dāng)盡可能地拓展到整個(gè)社會(huì)中去，以基層衛(wèi)生服務(wù)機(jī)構(gòu)為核心開(kāi)展HIV感染者的社區(qū)檢測(cè)，已成為迫在眉睫的社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)任務(wù)[20]。基層醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)機(jī)構(gòu)由于經(jīng)費(fèi)投入不足、醫(yī)務(wù)人員水平有限，適合使用價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便的一體化檢測(cè)設(shè)備，從而降低核酸檢測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)室及操作人員的要求。設(shè)備的各個(gè)樣本檢測(cè)模塊相互獨(dú)立，可以實(shí)現(xiàn)樣本的即到即檢。《“十三五”深化醫(yī)藥衛(wèi)生體制改革規(guī)劃》中強(qiáng)調(diào)建立科學(xué)合理的分級(jí)診療制度，提升基層醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)能力[21]。就HIV檢測(cè)而言，社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心等基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)由于存在場(chǎng)地及人員限制，大多不能進(jìn)行常規(guī)的核酸檢測(cè)，而近年來(lái)全自動(dòng)及集成化的HIV核酸即時(shí)檢測(cè)(pointofcaretesting，POCT)設(shè)備的發(fā)展，使得社區(qū)醫(yī)院及資源匱乏地區(qū)的HIV核酸檢測(cè)成為可能。傳統(tǒng)的PCR實(shí)驗(yàn)一般都要進(jìn)行樣本的裂解、核酸提取、純化及濃縮等繁雜的樣品制備過(guò)程，耗費(fèi)時(shí)間久[22]。近幾年市場(chǎng)上興起的微流控芯片技術(shù)為實(shí)現(xiàn)HIV核酸的即時(shí)檢測(cè)提供了很好的發(fā)展方向。微流控芯片又稱(chēng)芯片實(shí)驗(yàn)室(Labonachip，LOC)[23]，是指在幾平方厘米大小的芯片上構(gòu)建生物或化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。微流控技術(shù)具有所需樣品體積小、檢測(cè)效率高、使用成本低且具有良好的兼容性、有望實(shí)現(xiàn)便攜式檢測(cè)裝置等特點(diǎn)[24-25]。美國(guó)Cepheid公司開(kāi)發(fā)了一款從樣品中核酸的提取到完成PCR檢測(cè)完全實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的GeneXpert微流控核酸檢測(cè)系統(tǒng)，反應(yīng)中大多數(shù)液體是以凍干的形式預(yù)先填充的，大大減少了樣品混淆和操作錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)。從樣本的制備到完成測(cè)試出檢測(cè)結(jié)果僅需要半小時(shí)，減輕了操作者的工作強(qiáng)度。其研發(fā)的HIV定性檢測(cè)試劑靶基因?yàn)镠IV-1LTR區(qū)，可以對(duì)患者全血或者干血斑進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與AbbottM2000HIV-1realtime檢測(cè)試劑盒有較好的一致性[26]。Abbott公司的AlereqHIV檢測(cè)平臺(tái)只需要25uL外周血或血漿1h內(nèi)完成多重實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)來(lái)檢測(cè)HIV-1(M/N)亞型，HIV-1(O)亞型和HIV-2型病毒。羅氏公司生產(chǎn)的CobasLiat使用微流控芯片技術(shù)，通過(guò)擠壓PCR反應(yīng)試劑在三個(gè)擁有不同溫區(qū)的腔室內(nèi)來(lái)回移動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)所需要的溫度循環(huán)，這種以空間上的溫度循環(huán)來(lái)取代時(shí)間上的溫度循環(huán)的方式極大了縮減了PCR所需的反應(yīng)時(shí)間，可應(yīng)用于艾滋病的快速檢測(cè)，但空間域PCR需要更多樣化的以及更大的微流控平臺(tái)[27]。另外，2014年劍橋大學(xué)研發(fā)的全自動(dòng)SAMBA檢測(cè)平臺(tái)[28-29]可用于全血或血漿樣本的HIV核酸的快速檢測(cè)，其基于等溫?cái)U(kuò)增的原理，與AbbottRealTimeHIV-1檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)一致性可達(dá)98%[30]。上述幾種可用于HIV即時(shí)檢測(cè)的微流控核酸檢測(cè)設(shè)備產(chǎn)品比較情況，詳見(jiàn)表2。這幾種HIV微流控核酸檢測(cè)可以解決基層衛(wèi)生服務(wù)機(jī)構(gòu)或資源匱乏地區(qū)的HIV現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)環(huán)境及人員限制的問(wèn)題，使基層醫(yī)療單位具備開(kāi)展核酸檢測(cè)的能力。但是其儀器與試劑成本均較高(以GeneXpert為例，一臺(tái)儀器價(jià)格約在90萬(wàn)～120萬(wàn)左右)，且產(chǎn)品缺乏市場(chǎng)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，因此目前沒(méi)有大范圍推廣.

　　3家庭檢測(cè)

　　HIV家庭檢測(cè)的私密性高，產(chǎn)品便攜且便于使用，在說(shuō)明書(shū)的指導(dǎo)下即可完成操作，采樣過(guò)程簡(jiǎn)單，檢測(cè)過(guò)程需要很少或不需要試劑、設(shè)備，結(jié)果判讀簡(jiǎn)單，將是未來(lái)HIV檢測(cè)主要的發(fā)展方向之一。紙條檢測(cè)是最易于家庭使用的檢測(cè)方式，HIV抗原抗體檢測(cè)膠體金法已廣泛應(yīng)用于艾滋病篩查實(shí)驗(yàn)[31]，但是市場(chǎng)上HIV核酸檢測(cè)紙條檢測(cè)的相關(guān)應(yīng)用較少。2012年，美國(guó)休斯敦萊斯大學(xué)的RebeccaR.Richards-Kortum團(tuán)隊(duì)描述了一種紙條測(cè)定方法，該方法使用金納米顆粒探針和金增強(qiáng)溶液定量檢測(cè)擴(kuò)增的HIVRNA[32]，檢測(cè)時(shí)間只需20分鐘，每個(gè)試劑盒成本約為0.80美元。核酸紙條檢測(cè)在HIV即時(shí)檢測(cè)方面有巨大的潛力，其優(yōu)勢(shì)在于制備簡(jiǎn)單、成本低廉、操作易行、對(duì)環(huán)境友好，檢測(cè)時(shí)間短及結(jié)果可視化等，但在靈敏度方面還有很大的提高空間。由于分析物通過(guò)紙條傳送，局部分析物濃度可能因溶液擴(kuò)散而減少，而在多重檢測(cè)中有些信號(hào)分子可能會(huì)擴(kuò)散到鄰近通道[33]，因此還存在交叉污染的可能性，且目前核酸紙條的制備方法仍不成熟，這些因素限制了HIV核酸紙條檢測(cè)在市場(chǎng)的應(yīng)用。

　　4小結(jié)與展望

　　艾滋病的早發(fā)現(xiàn)早治療依賴于HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，而在眾多實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法中HIV核酸檢測(cè)窗口期短，靈敏度高，對(duì)艾滋病的早期診斷、病程檢測(cè)、抗病毒治療效果評(píng)價(jià)和耐藥性檢測(cè)等非常重要，但由于HIV基因存在多樣性，且高度變異，很難設(shè)計(jì)一套引物能夠覆蓋所有的HIV序列，因此檢測(cè)的靈敏度受到限制[34]，現(xiàn)有的HIV檢測(cè)方法或是操作復(fù)雜、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求較高或是儀器及試劑較為昂貴，檢測(cè)成本較高，既難以在一般的PCR實(shí)驗(yàn)室推廣，也不適合對(duì)大量病人的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，難以實(shí)現(xiàn)廣泛的臨床應(yīng)用。通過(guò)對(duì)當(dāng)前HIV核酸檢測(cè)的現(xiàn)狀分析可以發(fā)現(xiàn)，未來(lái)HIV核酸檢測(cè)的發(fā)展目標(biāo)是進(jìn)一步縮短檢測(cè)窗口期，提高檢測(cè)靈敏度、特異性，降低漏檢率，開(kāi)發(fā)出檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)單方便的檢測(cè)方法、試劑或儀器，且能夠降低檢測(cè)成本，使其能夠滿足基層醫(yī)療單位及欠發(fā)達(dá)地區(qū)艾滋病檢測(cè)實(shí)際工作的需要。微流控芯片技術(shù)能將樣本制備、核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)各個(gè)部分進(jìn)行整合，自動(dòng)化操作完成全過(guò)程，具有液體流動(dòng)可控、試劑消耗量小和分析速度快的特點(diǎn)[35-36]，將在未來(lái)HIV核酸檢測(cè)中發(fā)揮重要的作用。

　　《HIV核酸檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀》來(lái)源：《中國(guó)艾滋病性病》，作者：張雅 卓之豪 張師音